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Genomics

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DNA constituent structure

一些基本的生物学知识：

人类基因在分子层面由大量核苷酸序列（Nucleotide sequence）组成，核苷酸序列经过密码子翻译转化为氨基酸序列（Amino acid sequence）。

基因层面，核苷酸序列中不同的核苷酸排列会构成不同的基因区域来进行归类。编码蛋白质的区域包含如下区域：

  • 5' UTR（非翻译区）：基因的5'端区域，这部分不会被翻译成蛋白质，但在基因表达调控中起重要作用。需要注意的是5' UTR 在不同的基因中序列长度等都不同。

  • 外显子（Exon）：基因中真正被转录后并且在最终mRNA中保留下来，参与蛋白质编码的部分。

  • 内含子（Intron）：基因中不编码蛋白质的区域，通常在转录后会被剪接出去。

  • 开放阅读框（ORF, Open Reading Frame）：这是由多个外显子组成的序列，编码一个蛋白质。

  • 3' UTR（非翻译区）：基因的3'端区域，与5' UTR类似，不会被翻译成蛋白质，但也在调控基因表达方面起到作用。

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下面具体解释一下 DNA上5', 3' 和基因中 5'UTR, 3'UTR 的作用和关联。

5' 和 3' 在DNA链中指的是两个化学方向，分别与核苷酸的糖环上的第5号碳和第3号碳相连。5'端通常有一个磷酸基团，3'端有一个羟基基团。

在转录或复制时，DNA 或 RNA聚合酶只能将新的核苷酸添加到DNA 或 mRNA的3'端，因此mRNA链的生长方向是5'到3'。这是转录时普遍遵循的方向。而由于复制或转录经由DNA模板链，因此聚合酶读取DNA模板链的方向是3'到5'，因为合成的mRNA与模板链是反向互补的。

5' UTR（5'非翻译区）是mRNA的一部分，位于mRNA的5'端，但它不被翻译成蛋白质。

  • 在转录过程中，5' UTR也是从5'到3'方向合成的，与整个mRNA分子的方向一致。5' UTR是转录的起始部分，即最早合成的部分。

  • mRNA的翻译方向：5' 到 3'。

  • 核糖体从mRNA的5'端（通常是5' UTR之后的起始密码子AUG）开始移动，并读取mRNA的碱基序列，合成对应的多肽链。这个过程始终是从5'端向3'端进行。

  • 蛋白质合成的方向：合成的蛋白质链是从氨基端（N端）到羧基端（C端） 逐步延长的。这与mRNA的5'到3'方向对应。

在实际基因中，蛋白编码基因仅占1.5%，这是基因组中负责直接编码蛋白质的区域，尽管它只占很小一部分。大约 50% 的基因组由重复序列组成。重复序列是基因组中一种广泛存在的非编码DNA，包括简单序列重复，片段重复和长短散布原件。

转座子活动可以引发插入、删除、逆转录等变异。散布重复序列，如LINEs和SINEs，可以通过其移动能力促进基因组重组。此外还可能影响可变剪接，调控基因等。

内含子占了26%，即相当大的一部分基因组虽然不直接编码蛋白质，但有可能参与基因表达的调控。

其他大部分基因组成分包括：

  • LINES（长散布元件）：20%

  • SINEs（短散布元件）：13%

  • LTR转座子：8%

  • DNA转座子：3%

  • 简单序列重复：3%

  • 段重复：5%

  • 杂色异染色质：8%

  • 其他独特序列：12%

Epigenetic modifications

表观遗传学（Epigenetic modifications）是指基因序列不发生改变的情况下，调控基因表达的一系列化学修饰。这些修饰可以影响DNA的包装、可访问性以及基因表达水平，而不改变DNA的核苷酸顺序。常见的表观遗传修饰包括 DNA 甲基化（DNA Methylation）组蛋白修饰（Histone Modifications）等。

甲基化通常与基因的 沉默（关闭） 相关。它可以通过抑制转录因子的结合或者改变染色质结构，使某些基因不被表达。组蛋白修饰中的乙酰化（Acetylation）则通常与基因 激活（开启） 相关，乙酰基的添加使染色质结构变松，增加转录因子的结合。

在蛋白质合成前，DNA 转录得到前体mRNA（Pre-mRNA），然后经过添加头部、剪切mRNA最后添加尾部得到成熟的mRNA。

可变剪接（Alternative Splicing），是一个通过从同一基因的 前体mRNA（pre-mRNA） 中选择性地移除或保留特定外显子或内含子，生成多种不同mRNA形式（mRNA spliceforms）的过程。可变剪接使得一个基因可以产生多种不同的蛋白质，从而大大增加了基因表达的多样性。

DNA methylation

DNA甲基化的化学结构：

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甲基化是指在胞嘧啶（Cytosine）的碱基上，特别是在第5位碳原子上添加一个甲基基团（CH₃），生成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine）。

CpG二核苷酸位点（CpG dinucleotide sites），简称 CpG位点是指DNA中胞嘧啶（C）紧跟着鸟嘌呤（G）的序列，甲基化通常发生在这种C-G二核苷酸上。这些位点被称为 CpG 岛，在基因调控区尤其富集。

CpG位点具有对称性，双链DNA中的两个互补链都可以甲基化。

在DNA复制过程中，甲基化只会保留在母链上，而新链没有甲基化。

通过DNA甲基转移酶的作用，甲基化模式可以被复制到新生成的链上，确保遗传信息和表观遗传信息都能稳定传递给下一代。

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当CpG位点被甲基化时，DNA的结构更为紧密，转录因子难以接触到DNA，这会阻止转录的发生。这种情况下，基因表达受到抑制，转录被关闭。

当CpG位点未甲基化时，DNA处于较为开放的结构，转录因子和RNA聚合酶能够接触到启动子区域，进而激活基因的转录过程。这种情况下，基因能够正常表达，生成相应的mRNA。

甲基化的胞嘧啶（C）可能会自发发生脱氨作用，突变为胸腺嘧啶（T）。这种突变难以被DNA修复机制检测到，从而长期积累，导致CpG位点的减少。

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随着进化的进行，这种自发突变的积累使得基因组中的CpG位点相对于其预期频率显著减少。因此，CpG位点在基因组中是较为稀少的，特别是在长期进化过程中，频繁的C到T的突变积累导致这种现象更加明显。

因此，CpG岛通常位于基因启动子附近，而其他区域的CpG位点在漫长的进化过程中被突变掉的原因与DNA甲基化和突变的累积效应有关。在基因启动子附近区域，CpG位点常常是未甲基化的，从而保护它们不受突变的影响。

未甲基化的CpG位点由于没有受到甲基化修饰的影响，较少发生C到T的突变，因此这些区域的CpG位点较少减少。

CpG岛在基因启动子区域常常是基因调控的重要部分，它们保持未甲基化状态有助于保持基因的活跃表达。这种特点启示我们可以通过CpG岛出现频率来预测该基因区域是否为外显子区域。更广泛的，对于一段未知功能的基因片段，我们可以尝试通过一些特征预测该片段的功能。

Histone modifications

在电子显微镜下，DNA 被缠绕在一系列小球形结构上。这些小球是核小体。每个核小体的直径大约为100埃（Å）。这些核小体通过DNA链连接起来，形成了一种初级结构，称为100埃纤维。

核小体可以进一步堆积成更紧密的结构，形成300埃纤维，也被称为超螺旋结构。

这种分层的压缩结构有助于将人类细胞中非常长的DNA有效地压缩到细胞核内，并在必要时允许DNA解开进行基因表达或复制。

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核小体是染色质的基本单位，由约147个碱基对的DNA缠绕在八聚体组蛋白上形成。每个核小体包含四种组蛋白：H2A、H2B、H3和H4，各有两个副本，形成一个组蛋白八聚体（八个蛋白质单元）。

DNA分子绕组蛋白八聚体缠绕，包裹在这些蛋白上，形成紧密的核小体结构。核小体之间的连接DNA（linker DNA）则连接相邻的核小体，H1组蛋白位于连接DNA和核小体的结合处。

通过组蛋白尾部（H3 tail）的化学修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化等，细胞能够动态地改变核小体的松紧程度，从而调控基因的可接近性和表达状态。

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ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序） 是一种常用的技术，用来分析 DNA 与组蛋白之间的相互作用，特别是了解不同的组蛋白修饰如何调控基因表达。

ChIP-seq的工作流程：

  • 首先，将细胞中的染色质进行片段化处理，将DNA与组蛋白分开处理。然后通过特异性抗体来识别并结合特定的组蛋白修饰。例如，如果我们关心的是某种特定的组蛋白甲基化修饰，抗体会特异性结合到具有这种修饰的组蛋白上。

  • 与组蛋白修饰无关的片段，它们通过抗体无法结合，因此被排除。结合了抗体的片段（与特定组蛋白修饰相关），会通过免疫沉淀被捕获。

  • 抗体结合到组蛋白修饰后，结合的DNA也会一同被提取出来。然后通过DNA纯化步骤分离出与这些组蛋白修饰相关的DNA片段。

  • 接下来，这些片段可以被高通量测序，以识别哪些DNA序列与特定组蛋白修饰相关，从而得出染色质的调控信息。

  • 通过 ChIP-seq 技术，研究人员可以了解哪些基因区域与特定的组蛋白修饰相关，进而推断出基因调控的机制。例如，某些特定的组蛋白修饰（如H3K4me3）通常与基因的活跃表达相关，而其他修饰（如H3K27me3）则可能与基因沉默相关。

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在ChIP-seq实验中，经过免疫沉淀（通过特异性抗体捕获修饰的组蛋白及其结合的DNA）后，提取到的DNA片段会进行测序。这些片段对应于被特定组蛋白修饰所结合的DNA区域。

测序后的DNA片段被映射回基因组。图中红色条形代表了测序得到的片段，显示出这些片段沿着基因组的分布情况。这些片段的堆积表明这些区域与特定的组蛋白修饰高度相关，可能是基因调控的重要区域。

图中显示的红色峰值反映了在特定位置的修饰强度，峰值越高说明该区域可能是活跃的基因调控区。

这些信息可以帮助识别可能的增强子或启动子区域，因为这些区域的组蛋白修饰可能调控基因的表达。

Chromatin accessibility

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核小体将DNA压缩成紧密的染色质结构，部分区域的DNA可以暴露在外。这些暴露的DNA区域称为DNase超敏位点（DNase hypersensitive sites），它们通常位于启动子或增强子区域，表示基因调控区域容易被转录因子或其他蛋白质结合。

DNase-seq和ATAC-seq技术通过检测这些开放的DNA区域，识别染色质的可及性：

  • DNase-seq通过DNase I酶切割开放的DNA区域，从而识别暴露的DNA片段。

  • ATAC-seq则通过转座酶插入到开放的DNA区域，以类似方式识别这些可及区域。

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如图所示，绿色曲线表示ATAC-seq数据，蓝色曲线表示DNase-seq数据。峰值表示这些区域的DNA处于开放状态，提示这些区域可能是基因调控区域，如启动子或增强子。不同的峰值代表了染色质的不同可及性，越高的峰值表明该区域的DNA越容易被接触和调控。

染色质可及性的测量可以帮助研究人员识别哪些基因区域是开放的，并推测这些区域在基因调控中的角色。开放的DNA区域通常与活跃的基因表达相关，因此这些技术在研究基因调控元件（如增强子和启动子）方面具有重要应用。

3D organization and long-distance contacts

增强子（Enhancers）是远距离的调控元件，可能位于目标基因的1Mb（百万碱基对）以外。增强子能够通过染色质的三维结构与基因的启动子相互作用，帮助RNA聚合酶招募到启动子区域，从而启动基因转录。

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如图所示为两个增强子（Enhancer A 和 Enhancer B），它们通过染色质的环状结构靠近目标基因的启动子区域（Gene X的启动子）。染色质不是线性的，而是通过三维结构将远距离的DNA片段拉近，从而使增强子能够与启动子接触。

Cohesin复合物（绿色环）帮助介导这种三维染色质环的形成，允许增强子区域与目标基因的启动子发生物理接触。

增强子通常通过结合特异性转录因子（TFs），例如图中的TF符号，来实现对基因表达的调控。这些转录因子可以通过与增强子上的调控区域结合，招募其他蛋白质复合物（如RNA聚合酶）来启动基因的转录。

图中的Gene X的启动子区域与RNA聚合酶相互作用，并且通过增强子调控形成激活转录的复合物。这表明远距离的增强子可以通过染色质的3D结构调控基因表达。

Hi-C是一种用于测量染色体三维结构中DNA片段之间相互作用的技术。通过这种方法，可以识别哪些DNA序列在三维空间中靠近并可能相互作用。

Hi-C实验步骤：

  • DNA交联（Crosslink DNA）：

在细胞内，将染色质中的DNA片段通过甲醛交联，固定处于物理接触的DNA片段，使它们在实验过程中保持相对位置。这一步将原本相互作用的DNA片段“粘合”在一起，防止它们分离。

  • 酶切（Cut with restriction enzyme）：

使用特定的限制性内切酶（如HindIII），将DNA切割成小片段。这样处理后，靠近的DNA片段虽然被切断，但由于交联的存在，它们仍然保持结合在一起。

  • 末端填补并标记（Fill ends and mark with biotin）：

对切割后的DNA末端进行处理，用生物素（biotin）标记这些末端，以便后续步骤中可以通过生物素-链霉亲和素的亲和力将这些片段拉取出来。

  • 连接（Ligate）：

通过连接酶将相互作用的DNA片段连接在一起。在这一步，空间上靠近的DNA片段会被物理连接到一起形成新的DNA片段。这些相互作用的DNA片段通常来自基因组的不同位置。

  • 纯化并剪切DNA（Purify and shear DNA）：

通过生物素拉取标记的DNA，并进一步剪切成更小的片段，为测序做好准备。

  • 测序（Sequence using paired-ends）：

最后，使用双端测序（paired-end sequencing）对相互作用的DNA片段进行测序。双端测序能够同时读取DNA片段的两端，因此可以确定在三维空间中靠近的DNA序列是哪两部分。

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通过 Hi-C 方法，我们可以得到接触频率矩阵，显示染色质的三维结构中不同片段之间的相互作用频率。矩阵中的红色对角线表示同一个染色体上相邻的DNA片段，因为这些片段自然在物理空间中靠近，所以接触频率较高。

越远离对角线的区域，代表染色质中更远的片段相互作用。矩阵中的亮点或块通常代表染色质环（chromatin loops）或拓扑关联结构域（TADs）。

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TADs 是染色质的功能结构单位，在三维空间中将染色质分隔成相对独立的区域。TAD 通过 CTCF 等结合位点和边界蛋白维持，基因表达和调控元件（如增强子、启动子）通常局限于 TAD 的内部。

TAD边界（TAD boundary）由某些特定的DNA序列（如CTCF结合位点）或基因元件组成，它们能够阻止调控元件跨域相互作用。这可以确保增强子不会激活相邻TAD内的基因。

TAD的边界和三维结构对于基因表达的精确调控至关重要。如果TAD边界受损或改变，可能导致基因误表达。

在活跃的TAD中，基因受到积极调控，而在被抑制的TAD中，基因表达被关闭。

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CTCF Motif Orientation（CTCF结合位点方向）：

  • 这条蓝色和红色的线条代表CTCF结合位点的方向性。

    • 蓝色条线表示CTCF结合位点的正向（Forward）。

    • 红色条线表示CTCF结合位点的反向（Reverse）。

  • CTCF是维持TAD结构和边界的关键蛋白。CTCF结合位点的方向性影响着染色质的折叠方式，并决定了TAD的形成。在TAD边界处，CTCF正反向结合位点通常成对出现，这有助于染色质环状结构的形成，隔离不同TAD内的基因调控活动。

CTCF信号（CTCF Chip-seq轨迹）：

  • 这条蓝色的曲线代表CTCF的ChIP-seq（染色质免疫共沉淀结合测序）信号，展示了基因组上CTCF蛋白实际结合的区域。

  • 高峰代表CTCF结合的位点，与上面的“CTCF Motif Orientation”对应。这些结合位点通常位于TAD边界处，起到隔离和限制相邻TAD之间基因调控相互干扰的作用。

Rad21信号（粘合素复合体的信号）：

  • 这条黑色曲线代表Rad21的ChIP-seq信号。Rad21是粘合素复合体的核心成分，负责染色质的环化结构（loop formation），在维持染色质的三维结构中发挥作用。

  • Rad21与CTCF结合位点协同工作，参与TAD的形成。Rad21的高峰往往与CTCF的结合位点一致，帮助稳定TAD内的染色质相互作用。

基因分布轨迹：

  • 蓝色条带代表基因的分布，显示了基因的位置。图中标示了几个关键基因（如TBX5、TBX3等）的具体位置。

  • 这些基因位于TAD内部，意味着它们的调控活动主要发生在各自的TAD中，而不是跨越TAD边界进行相互作用。

RNA表达量（绿色轨迹）：

  • 绿色曲线代表RNA表达的水平（通常来源于RNA-seq数据），显示哪些区域的基因在被积极转录。

  • 高峰表示RNA表达水平较高，意味着这些区域的基因处于活跃状态。通常这些基因位于TAD内部，且与TAD内部的调控元件（如增强子）相互作用。

H3K27ac信号（橙色轨迹）：

  • 这条橙色的曲线代表组蛋白修饰H3K27ac（组蛋白H3第27位赖氨酸的乙酰化修饰）的信号。

  • H3K27ac是基因活跃的标志，通常出现在活跃的启动子和增强子区域。H3K27ac的高峰表示该区域的基因调控活动活跃，增强子可能参与了TAD内基因的调控。

总体而言，通过各种实验技术，我们能够得以进行统计分析，进一步识别和理解基因组中的不同功能区域，如增强子、启动子、基因等。